实验一质粒的制备

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

一、实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

二、实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。

三、实验原理：在pH 12.0～12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

四、实验步骤：

1．取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；

2．用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床，250 r/min过夜培养；

3．吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4．加入300μl溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；

5．加入300μl溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6．加入300μl溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；

7．12000 g离心10分钟；

8．吸取800μl上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9．12000 g常温离心15分钟；

10．倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11．室温放置或超净台上风干DNA；

12．加40μl灭菌超纯水或TE溶解；

13．质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。

实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

一、实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

二、实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。

三、实验原理：在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

四、实验步骤：

1．用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

2．调整好梳子的高度；

3．称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50℃时倒入制胶板中；

4．凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；

5．将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；

pUC18 5μl + ddH2O 3μl +溴酚蓝2μl共10μl于0.5ml tube中混合后点样；

6．将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

7．电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆

DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。

一、实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。

二、实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段，克隆载体为PUC18。

三、实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

四、实验步骤：

1．载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：

（50μl反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）

DNA 30 μl

R.E 1 μl

10 × buffer 5 μl

ddH2O 14 μl

37℃反应1hr，分别取8μl外源片段酶切产物和5μl PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA

2．加入ddH2O 150μl（扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min；

3．吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上；

4．12000g4℃冷冻离心15分钟；

5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10μl ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20μl ddH2O（1.5ml tube中）；

6．按以下反应去除载体PUC18的5 '磷酸基团，50℃反应30 min以上

DNA 20 μl

CIAP（TaKaRa） 0.5μl

10×buffer 4.0 μl

ddH2O 15.5 μl

7．70℃水浴10 min,使CIAP失活；

8．按2－5步纯化载体，溶于10μl ddH2O；

9．连接反应（15μl体系）：

DNA 10 μl

pUC18 2.5 μl

5×buffer 1.5 μl

T4 ligase (3U/ μl) 1 μl

16℃水浴过夜

10．转化大肠杆菌感受态细胞

11．转化子的鉴定

实验四感受态细胞的制备

体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。

一、实验目的：学习感受态细胞的制备过程

二、实验材料：大肠杆菌菌株DH5α或DH10B

三、实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109～1010转化子/μg DNA；

对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106～107转化子/μg DNA。

·CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤

1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；

2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；

3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；

以下步骤需在超净工作台和冰上操作

4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

8．弃去上清，加入100μl预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；

2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；

3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作

4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；

5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；

6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

7．4℃下3000g冷冻离心5分钟

8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

9．4℃下3000g冷冻离心5分钟

10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；

11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

实验五质粒的转化及转化子的鉴定

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

一、实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。

二、实验材料：外源片段与载体的连接产物，大肠杆菌感受态细胞。

三、实验原理：

（1）热激法：大肠杆菌在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

热激法转化实验步骤：

1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250μl Amp（100mg/ml），250μl X-gal (20mg/ml)，25μl IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；

2．取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3．每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；

4．热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；

5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；

6．复苏：每管加400μl SOC培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；

7．涂皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；

8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）

质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤

1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中加入250μl Amp（100mg/ml），250μl X-gal (20mg/ml)，25μl IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；

2．取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3．每管感受态细胞加入1μl连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；

4．电转化仪选择1800V作为输出电压；

5．将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电击；

6．立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞；

7．将细胞转入合适的培养管中37℃培养1小时；

8．吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；

9．37℃培养过夜，观察结果。

实验六PCR技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中的常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。

一、实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程

二、实验材料：转基因水稻叶片总DNA，外源基因的特异引物

三、实验原理：PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。

四、实验步骤：

1．调整模板浓度至5 ng/μl；

2．按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心5秒

Template DNA 2μl（20 ng）

10 × buffer 2.0 μl

MgCl2（25mM） 1.5μl

Primer F (10μM) 0.2 μl

Primer R (10μM) 0.2 μl

dNTPs（2mM） 2.0μl

Taq（5U/μl） 0.2μl

Add ddH2O to 11.9 μl

3．PCR反应循环条件设置：

95℃ 3' 1 cycle

94℃ 1' 57℃ 1' 72℃ 1'30" 35 cycles

72℃ 8' 1 cycle

4℃ forever

4．检测：加2μl溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15μl反应产物点样电泳；

5．在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳。EB染色，紫外观察。