植物内生菌菌种常规保藏技术规程

微生物菌种常规保藏是一类重要的基本操作技术，是保护微生物菌种资源的重要手段。如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。

本规程包括定期移植保藏法、液体石蜡保藏法和沙土管保藏法三种常用微生物菌种保藏方法。制定本规程是为了规范植物内生菌剂其他微生物菌种常规保藏技术操作，加强管理，以达到保护植物内生菌及其他微生物菌种资源，实现资源共享的目的。

1、范围

本规程适用于本平台收集的植物内生菌菌种及其他微生物。

2、保藏技术

2.1斜面保藏

适用范围：大多数细菌和真菌。斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上，然后在低温条件下保存。

技术要求：

① 不同菌种应根据要求选择合适的培养基。

② 接种时要求无菌操作，避免染菌。

③ 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。

保存方法：制作合适的培养基，调节pH，然后进行高温高压灭菌处理，制作斜面然后将需要保存的菌株接种到斜面，培养箱中培养一定时间于4℃保藏。

保存时间：3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。

2.2 矿物油中浸没保藏

适用范围：可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。

技术要求：首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口。

保存方法：将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏。

保存时间：1~2年。

2.3冷冻保藏

定义：冷冻保藏是指将菌种于-20℃以下的温度保藏，冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了保藏的结果更加令人满意，通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂；同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。

2.4 长期保藏

参考本平台制定的《植物内生菌菌种冷冻干燥、低温保藏技术规程保藏技术规程》进行。

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2017 年5 月15 日