细胞是植物结构与功能的基本单位，原生质是细胞中有生命的部分。死、活细胞原生质的理化性质有本质的差别。如活细胞的原生质膜系统具有半透性，可与外界溶液构成渗透系统，活细胞可主动积累某些溶质等；而死细胞丧失了这些特性。通过细胞活体染色质壁分离现象的观察，了解原生质体的某些性质，如粘滞性等，以加深对有关理论的理解。
【原理】
活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH 6.4～8.0之间（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中分泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
【仪器设备】
1.显微镜； 2.小培养皿；
3.载玻片和盖玻片； 4.单面刀片；
5.尖头镊子； 6.酒精灯；
7.火柴； 8.擦镜纸；
9.吸水纸适量。
【试剂】
1. 0.03﹪中性红溶液； 2. 1 mol · L-1硝酸钾溶液。
【材料】
洋葱鳞茎（或大葱假茎基部）及小麦叶片。
【方法步骤】
1.切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5 cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内侧向下）。若用小麦叶片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片上，再将此载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀片从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到只剩下少量叶肉细胞时要十分小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除小麦外其他禾本科植物也可用此法制备表皮细胞制片。将刮好的制片切成约0.5 cm2小块。
2.将制好的洋葱鳞茎内表皮或小麦叶片上表皮小块投入0.03﹪的中性红溶液中染色5～10 min，取出1～2片，在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴1滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察，可看到细胞壁被染成红色，而原生质和液泡均不染色。
3.将步骤2中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10～15 min，再置于载玻片上镜检，将发现细胞壁脱色，而液泡却被染成深红色。
为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1 mol · L-1的硝酸钾溶液中浸泡10 min左右，然后取出观察。由于硝酸钾能使原生质强烈膨胀，发生帽状质壁分离，因而能清楚地区别开无色透明的原生质和染成红色的液泡。
4.将步骤3中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察，会看到原生质凝结成不均匀的凝胶状，与细胞核一起被染成红色。
5.在活体染色制片中仔细寻找，可能看到个别死细胞，其细胞核因被中性红染色而呈红色，清晰可辨。
【原理】
植物细胞常因原生质和细胞壁结合的紧密程度或原生质的粘性大小而表现不同的质壁分离形式。质壁分离主要有两种形式：凸形和凹形，有时把严重的凹形质壁分离叫做痉挛形质壁分离。质壁分离最初由凹形开始，以后或保持这一形式，或逐渐转为凸形。保持凹形质壁分离的时间长短与原生质的粘性关系很大，凡是原生质粘性大的，能维持较长时间的凹形，甚至成为痉挛形，而原生
质粘性很低的，则较快地转为凸形质壁分离。
本实验将观察由于Ca2+、K+对原生质粘性的不同影响而发生不同形式的质壁分离现象。经Ca2+处理后，发生凹形质壁分离，经K+处理后则发生凸形质壁分离。当用KNO3的高渗溶液进行长时间质壁分离时，由于细胞质强烈膨胀、变厚，似帽状包围在收缩的液泡两端，因此称为帽状质壁分离。此时能清楚地区别无色透明的原生质和染成红色的液泡。
【仪器设备】
见本实验项目一。
【试剂】
1. 0.03﹪中性红溶液；
2. 1 mo l · L-1硝酸钾溶液；
3. 1 mol · L-1氯化钙溶液。
【方法步骤】
1.按本实验项目一的方法，制取洋葱内表皮或小麦叶表皮活染制片各2份，分别置于载玻片上，一片滴加1～2滴1 mol · L-1硝酸钾溶液，另一片滴加1～2滴1 mol · L-1氯化钙溶液，盖上盖玻片立即进行镜检，可见钾盐溶液使细胞发生凸形质壁分离，放置约10 min后可见帽状质壁分离；而钙盐溶液处理的则发生凹形或痉挛形质壁分离，经较长时间（10～20 min）后，可能有部分细胞原生质全部离开细胞壁，原生质体受表面张力的影响而转变为凸形质壁分离，但绝不会发生帽状质壁分离，可与K+处理的相区别。
2.从观察到的凹形、凸形、帽状等不同形式的质壁分离中选择典型的细胞各绘一图，并解释观察结果及其原理。
【思考题】
1.渗透作用在植物生理上有何意义？
2.质壁分离在细胞生理的研究上有那些用处？
实验3 植物组织水势测定
【原理】
当植物组织和外界蔗糖溶液接触时，若组织水势小于外液渗透势，水分进入植物组织，外液浓度增高；相反，组织水分进入外液，使外液浓度降低；若二者水势相等，组织不吸水也不失水，外液浓度不变。溶液浓度不同，比重不同。取浸过组织的蔗糖溶液一小滴(为便于观察加入少许甲烯蓝)，放入未浸植物组织的原浓度溶液中，观察有色溶液的浮沉：液滴上浮，表示浸过样品后溶液浓度变小；液滴下沉，表示溶液浓度变大；若液滴不动，表示浓度未变，该溶液水势即等于植物组织水势。实际测定时，常常不易找到有色液滴不动的溶液，而是取接近植物组织水势的相邻两种溶液浓度的平均值。
【仪器设备】
1.水势测定取样箱(大小根据需要确定，其中放湿润滤纸，保持高相对湿度)；
2.小试管(12×100 mm)36～48个，洗净烘干；
3.大试管：15×150 mm，18～24个，洗净烘干；
4.毛细移液管：36～48个，洗净烘干；
5.剪刀、刀片、打孔器、1个镊子各1把；
6.干净硬纸片：20×20 cm，2张；
7.试管架：2个。
【试剂】
1.蔗糖溶液：按重量法试剂配制要求配制1mol/L蔗糖溶液。2.甲烯蓝(或0.03%中性红)溶液。
【材料】
欲测的植物组织。
【方法步骤】
1.取5～6个干净的小试管和相同数量的大试管(15×150 mm)，贴不同水势(或浓度)标签。向大试管中加入1mole蔗糖溶液分别为1、2、3、4、5、6ml，依次再加入蒸馏水为9、8、7、6、5、4ml使各试管总体积为10 mL，摇匀，即为不同浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mole（或水势）蔗糖溶液。
2.剪取欲测叶片，用刀片切成0.5×0.5 cm2小片，混匀，分别装入小试管底部，每瓶装8片左右。向各小试管分别加入不同水势蔗糖溶液4～5滴，摇匀，放一小滴甲烯蓝溶液（或中性红溶液），加盖保持20～30min。
3.用干净的毛细移液管，吸挤小试管底部蓝色溶液，使其充分混合均匀，并吸取1～2滴，小心地插入装着相对应同浓度蔗糖溶液大试管中部，轻轻地挤出一小滴蓝色溶液，慢慢转动毛细管头部，抽出毛细移液管，观察蓝色液滴流动方向。
【结果计算】
蓝色溶液不动的试管或蓝色液滴上浮、下沉的两个相邻试管蔗糖浓度的平均值，即为等势点。
假如蔗糖溶液按水势值配制，测出结果不必再进行运算。若蔗糖溶液按摩尔浓度配制，按下式计算植物组织水势。
ΨW =-i RTC
式中，ΨW：由蔗糖溶液换算为植物组织水势，单位为大气压，最后变为巴(1.013 bar=1 atm)，再换算为MPa (1 MPa=10bar)；C：溶液的质量摩尔浓度(mol · kg-1)；R：气体常数，0.008314 MPa · L · mol-1· K-1；T：绝对温度K，即273 +t(t为当时温度)；i：解离常数(蔗糖=1)。
【注意事项】
1.小液流法中用的毛细移液管尖端需弯成直角，以保证从滴管出来的液滴不受向下力的影响。
2.毛细管移液管延试管壁慢慢抽出，以防溶液振动，影响蓝色液滴的运动
植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质元素，否则植物就不能很好地生长发育甚至导致死亡。应用溶液培养和砂基培养是研究矿质营养的重要方法，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养来研究矿质元素对植物生长发育的影响，可以避免土壤中其它因素对植物产生的影响。近年来溶液培养方法已广泛应用于商业生产中。
【原理】
植物必需有某些必要的矿质元素的供应，才能保证正常的生长发育，如缺少某一元素，便表现出缺素症。把这些必要的矿质元素用适当的无机盐配成培养液，即能使植物正常生长，这就是溶液培养。应用此方法，所用元素的种类和用量可完全人为地加以控制。要了解某元素缺乏所引起的生理病症，可从培养液中减去该元素，以便在以后的生长过程中进行观察。这类实验，通常用溶液培养，为了管理方便，也常将溶液加入洁净的石英砂培养植物，则称为砂基培养。
【仪器设备】
1.烧杯：250、500 mL各1个； 2.刻度移液管：5 mL 10支，1 mL1支；
3.量筒：1000 mL 1个； 4.黑色腊光纸适量；
5. 15×15 cm塑料纱网（或纱布）：1块； 6.搪瓷盘（带盖）：1个；
7.石英砂适量； 8.陶质花盆：1个；
9. 500 mL试剂瓶：11个；
10.培养缸（可用1000 mL玻璃质或瓷质培养缸）：7个。
【试剂】
1.硝酸钾； 2.硫酸镁；
3.磷酸二氢钾； 4.硫酸钾；
5.硫酸钠； 6.磷酸二氢钠；
7.硝酸钠； 8.硝酸钙；
9.氯化钙； 10.硫酸亚铁；
11.硼酸； 12.氯化锰；
13.硫酸铜； 14.硫酸锌；
15.钼酸； 16.盐酸；
17.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）。
【材料】
玉米、番茄、向日葵种子。
【方法步骤】
1.供试苗培养：取250 mL烧杯一个，在烧杯口紧扎塑料纱网或纱布一块，将烧杯放在另一个500 mL烧杯中，加水使水面几乎与内部烧杯口相平。
将浸种一夜的番茄或玉米种子均匀地排列在纱网上，在大烧杯上盖一块玻璃片，然后放置在温暖处发芽。待子叶完全展开后，改用稀释培养液（浓度为完全培养液的1/4）培养。培养玉米苗可一直用水培养。当番茄苗高4～5 cm左右，展开第一真叶或玉米幼苗出现第二真叶，选择生长一致的幼苗作实验材料，移往各种缺素溶液中。移植时注意勿损根系。有时也可用花盆装石英砂或洁净的河沙培养苗，但移植要早些，以免伤根。
表3-1大量元素配置表
|
营养盐 |
浓度（g· L-1） |
|
Ca(NO3)2· 4H2O |
236 |
|
KNO3 |
102 |
|
MgSO4· 7H2O |
123 |
|
KH2PO4 |
54 |
|
K2SO4 |
176 |
|
CaCl2 |
111 |
|
NaH2PO4 |
48 |
|
NaNO3 |
170 |
|
Na2SO4 |
71 |
|
EDTA-Fe
（由以下两种试剂混合加热溶解）
EDTA-Na
FeSO4· 7H2O
微量元素 |
7.45
5.57
称取H3BO32.86 g，MnCl2· 4H2O 1.81 g，
CuSO4· 5H2O 0.08 g,ZnSO4· 7H2O 0.22 g,
H2MoO4· H2O 0.09 g于1L蒸馏水混溶 |
表3-2 缺素培养液的配制
|
贮备液 |
每100 mL培养液中贮备液的用量（mL） |
|
完全 |
缺N |
缺P |
缺K |
缺Ca |
缺Mg |
缺Fe |
|
Ca(NO3)2 |
0.5 |
－ |
0.5 |
0.5 |
－ |
0.5 |
0.5 |
|
KNO3 |
0.5 |
－ |
0.5 |
－ |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
|
MgSO4 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
－ |
0.5 |
|
KH2PO4 |
0.5 |
0.5 |
－ |
－ |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
|
K2SO4 |
－ |
0.5 |
0.1 |
－ |
－ |
－ |
－ |
|
CaCl2 |
－ |
0.5 |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
|
NaH2PO4 |
－ |
－ |
－ |
0.5 |
－ |
－ |
－ |
|
NaNO3 |
－ |
－ |
－ |
0.5 |
0.5 |
－ |
－ |
|
Na2SO4 |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
0.5 |
－ |
|
EDTA-Fe |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
－ |
|
微量元素 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
0.1 |
2.配制大量元素、铁盐和微量元素的贮备液：用蒸馏水按表3-1所列各化合物的克数，分别配置贮备液1000 mL。
配好以上贮备液后，再按表3-2配成完全培养液和缺乏某种元素的培养液（用蒸馏水）。
3.将以上配制的培养液各800 mL分别加入1000 mL培养缸中，瓶外加黑色腊光纸套（黑面向里）或用报纸包三层，瓶上用马粪纸板涂腊后做成盖，并用打孔器在盖中间打一圆孔，用棉花把植株幼茎通过小孔固定在盖上，使整个根系浸入培养液中，装好后将培养瓶放在阳光充足、温度适宜（20～25 ℃）的地方。
4.实验开始后，每两天观察一次，用精密pH试纸测试培养液的pH值，如pH高于6，应以稀盐酸调整到5～6之间。注意记录缺乏必需元素时所表现的症状及最先出现症状的部位。培养液每周更换一次。为使根系生长良好，最好应在盖与溶液之间保留一定空隙，以利通气。待各缺素培养液中的幼苗表现出明显的症状后，将缺素培养液全部更换为完全培养液。观察症状逐渐消失的情况，记录结果。
【注意事项】
1. 配制贮备液时务必先大量加水到一定体积，随后再加入试剂，并按顺序先加入钾盐、钠盐、硝酸盐等易溶物质，待充分溶解并搅拌均匀后再加入溶解度较小的物质。
2. 铁盐贮备液应避光保存。
【思考题】
1. 为什么说溶液培养是研究矿质营养的重要方法？
2. 根据实验结果叙述番茄、玉米、向日葵幼幼苗缺乏大量元素时所表现的症状并分析其原因。
根系是植物对水分和矿质营养的主要吸收器官，同时又是植物体中重要物质如氨基酸、激素等物质合成、同化、转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平。本实验练习测定根系吸收面积和活力的方法，以为植物营养研究提供依据。
【原理】
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80毫伏的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即通过下列反应，生成红色而不溶于水的三苯基甲月朁（TTF）。
TTC（无色） TTF（红色）
生成的甲月朁呈稳定的红色，不会被空气中的氧自动氧化。所以被广泛地用作酶试验的氢受体。植物根引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。所以，它能够测定琥珀酸脱氢酶的活性，由该酶活性表示根系活力。
【仪器设备】
1. 721型分光光度计； 2.分析天平（感量0.1mg）；
3.托盘天平（感量0.1 g）； 4.温箱；
5.研钵：1套； 6. 4 cm漏斗：2个；
7.量筒10 mL：1个； 8.刻度移液管：0.5 mL、2 mL、5 mL；
9. 10 mL容量瓶（或10 mL具塞刻度试管）：8个；
10.试管架：1个； 11.石英砂适量；
12.高型称量瓶（30×60 mm）：2个。
【试剂】
1.乙酸乙酯（分析纯）；
2.连二亚硫酸钠（Na2S2O4）,分析纯，粉末；
3. 1 %TTC溶液：准确称取TTC 1.0000 g，溶于少量水中，定容到100 mL。用时稀释至需要浓度；
4. 0.1mol · L-1pH 7.5磷酸缓冲液；
5. 1 mol · L-1硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000 mL；
6. 0.4mol · L-1琥珀酸：称取琥珀酸4.72 g，溶于水中，定容至100 mL。
【材料】
水培或砂培的植物材料（需洗净），玉米浸种24 h左右，在实验前1周发芽做好材料准备。
【方法步骤】
1. 定性测定：
（1） 配制反应液：把1 %的TTC溶液，0.4％mol · L-1的琥珀酸和0.1 mol · L-1pH 7.5磷酸缓冲液按1∶5∶4的比例混合。
（2） 将根仔细洗净，把地上部分从茎基切除。然后将根放入带盖的称量瓶中，倒入反应液，以浸没根为度。置37 ℃暗箱中1 h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及侧根部分明显地变成红色，表明该处具有活跃的脱氢酶存在。
2. 定量测定：
（1） TTC标准曲线的制作：吸取0.1 mLTTC标准液（含TTC 10 mg · mL-1）放入10 mL容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后即产生红色的甲月朁。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL置10 mL容量瓶中，以乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月朁0.025、0.05、0.10、0.15、0.20 mg的标准比色系列。以空白作参比，在485 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（2） 称取材料根尖1cm切段0.5 g，放入称量瓶，加入1 % TTC溶液和0.1 mol · L-1磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37℃下保温1 h。此后加入1 mol · L-1硫酸2 mL，以终止反应。
（3） 把根取出，擦干水分后与3～5 mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研钵内研碎，以提取甲月朁。把红色浸提液滤入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，滤入试管，最后用乙酸乙酯定容10 mL。用分光光度计在波长485 nm下比色，以空白试验（先加入硫酸再加入根样品，其它步骤同上）作参比读出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量。
（4） 计算：
【注意事项】
在对材料根系的操作中切忌对根的损伤，以免对实验结果带来影响。
【思考题】
试分析活力测定中根系着色深浅不同的原因。
【原理】
硝酸还原酶是植物氮素同化的关键酶，也是一种诱导酶，与作物吸收和利用氮肥有关，可催化硝酸盐还为亚硝酸盐：
产生的
在酸性条件下可以与对-氨基苯磺酸（sulfanilic acid）或磺胺（对-氨基苯磺酰胺，sulfanil-amide）反应生成重氮盐，再与α-萘胺反应生成红色偶氮化合物（对苯磺酸-偶氮-α-萘胺）。
生成的红色偶氮化合物在520 nm波长下有最大吸收值，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可以每h每克鲜重产生的 μg数表示酶活性（ μg · g-1FW· h-1）。
根据材料处理不同可分为活体法与离体法，根据反应介质的不同则可分为内源基法和外源基质法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。内源基质法测定结果可反映硝酸还原酶在实际生长条件下的还原力，而外源基质法测定结果则可反映硝酸还原酶的潜在或最高还原力。
【仪器设备】
1.分光光度计； 2.真空泵；
3.真空干燥器； 4.天平(感量0.1 mg)；
5.恒温培养箱； 6.三角瓶（50 mL）；
7. 1 mL移液管； 8. 5mL移液管；
9. 10 mL试管； 10.试管架；
11.直径1 cm打孔器。
【试剂】
1．0.1 mol · L-1pH 7.5磷酸缓冲液(Na2HPO4· 12 H2O取30.0905 g与Na2HPO4· 2H2O取2.4965 g,用蒸馏水定容至1000 mL)；
2．30 %的三氯乙酸(30 g三氯乙酸,水溶后定容至100 mL)；
3．0.2 mol · L-1KNO3（20.22 gKNO3用蒸馏水定容于1000 mL）；
4．磺胺试剂（1 g磺胺，加25 mL浓盐酸，用蒸馏水定容于100 mL）；
5．α-萘胺试剂（0.2 gα-萘胺，用含1 mL浓盐酸的蒸馏水定容于100 mL）；
6．5μg · mL-1NO2-标准液(0.10 g NaNO2用蒸馏水定容至100 mL，吸取7.5 mL，再用蒸馏水定容至1000 mL)。
【材料】
欲测植物材料(如叶菜类蔬菜,实验材料在实验前一天可用硝态氮肥处理,以增强硝酸还原酶活性)。
【方法步骤】
1．标准曲线制作 取7支15 mL刻度试管,按下表顺序加试剂。
2．取新鲜植物组织洗净，拭干。如果是叶片可去主脉，打成直径1 cm的圆片，若是根、茎可切成0.1 cm厚的薄片。
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试管编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
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5 μg · mL-1NO2-标准液mL |
0 |
0.2 |
0.4 |
0.8 |
1.2 |
1.6 |
2.0 |
|
蒸馏水mL |
2.0 |
1.8 |
1.6 |
1.2 |
0.8 |
0.4 |
0.0 |
|
每个试管中NO2-含量μg/mL |
0 |
0.5 |
1.0 |
2.0 |
3.0 |
4.0 |
5.0 |
|
磺胺及α-萘胺 |
每管加磺胺试剂2mL，α-萘胺试剂2mL，然后静置30 min |
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520 nm比色，吸光值（A） |
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回归曲线 |
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*可用坐标纸制作标准曲线 |
3．取上述材料4份，每份50片，称重后分别放入4个50 mL三角瓶中，其中1个为空白，3个用于酶活性测定，分别记为重复1、2、3。
4．在空白瓶中先加1 mL 30 %三氯乙酸，然后在每个三角瓶中加入0.1 mol · L-1pH 7.5磷酸缓冲液5 mL、蒸馏水5 mL（内源基质法）。如果是外源基质法，则将蒸馏水换为5 mL 0.2 mol · L-1KNO3。
5．将三角瓶置于真空干燥器中抽气至样品完全沉入溶液中（约10 min）。
6．取出三角瓶，30 ℃避光30 min；之后在重复中也分别加入1mL30 %的三氯乙酸以终止反应,摇均。
7.吸取2 mL（若反应液浓度太大，可吸取1 mL加1 mL水）反应液于10 mL试管中，加磺胺试剂2 mL，α-萘胺试剂2 mL，静置30 min；比色，记下吸光值（A）；
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实验结果 |
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空白 |
重复1 |
重复2 |
重复3 |
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鲜重 |
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吸光值（A） |
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NO2-含量C（μg · mL-1） |
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|
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酶活性 μg · g-1FW · h-1 |
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平均值 |
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8.从标准曲线中检出NO2-含量（μg · mL-1），以每h每克鲜重产生的NO2–μg数表示酶活性，计算方法：
式中：C为根据回归曲线计算的 μg数；Vt为反应液总体积（mL）；Vs为测定时取样体积（mL）；FW为鲜重（g）；t为反应时间（h）。计算时，先分别计算3个重复的结果，再算平均值，为所求结果。
【原理】
叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素不溶于水，能溶于有机溶剂，且各种色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。色谱法中最简便的是纸层析法。当溶剂不断地从纸上流过时由于混合物中各成分在两相(流动相和固定相)间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，因而使各种色素的混合物分离。
【仪器设备】
1.托盘天平； 2.研钵；
3.漏斗、漏斗架； 4.玻棒；
5.剪刀； 6.三角瓶；
7.烧杯； 8.滤纸条；
9.毛细管； 10.带木塞的大试管；
11.分液漏斗； 12.试管；
13.量筒。
【试剂】
1. 95 %乙醇； 2.汽油(纯净无色的)；
3.苯； 4.石油醚；
5. 92 %甲醇； 6. 20 % KOH甲醇；
7.乙醚。
【材料】
新鲜植物叶片或80 ℃以下烘干的干叶粉如菠菜、萝卜及无花果叶片。
【方法步骤】
1.叶色素的提取：
(1)取新鲜植物叶子，先在105 ℃下烘20 min，再在80 ℃下烘干，研成粉末，密闭贮存备用。也可用鲜叶直接提取。
(2)称取叶粉2 g放入小烧杯中，加入95 %乙醇20～30 mL，置70 ℃水浴中浸提。浸提中需用玻棒经常搅动，如气温过低亦可适当加热。待乙醇呈深绿色时，将溶液过滤到另一烧杯或三角瓶中待用。如用鲜叶提取，可将剪碎的鲜叶10～15 g放入研钵中，加少量CaCO3粉及95 %乙醇5～10 mL，研磨成糊状。再加入乙醇20 mL左右，充分混匀，以提取叶匀浆中的色素。5～10 min后，过滤入三角瓶中，加10 g左右无水碳酸钠以除去提取液中的水分。将提取液转入另一三角瓶中加塞待用。
2.叶色素的分离：
(1)叶色素纸型色层分离：
①取一张圆形色层分析滤纸（直径为9或12cm），直径略大于培养皿的直接。在滤纸的圆心戳一圆形小孔，另取同样的滤纸，剪成长5cm、宽1.5cm的纸条，用吸管吸取叶绿素提取液滴在纸条一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm内，风干后再重新操作数次，然后将纸沿着长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿素溶液的一侧恰在纸捻的一端。
②将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。
③在培养皿内放一小玻璃杯（或用康卫皿），小杯内加入适量的汽油并加1～2滴苯。把插有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入汽油中，迅速盖好培养皿（图3）。此时，汽油借毛管引力顺纸捻扩散到圆形滤纸上，并把叶绿体色素沿滤纸向四周推进，不久可以看到被分离的各种色素的同心环；最外面为胡萝卜素为橙黄色，一次向里叶黄素为米黄色，叶绿素b为黄绿色，最里面叶绿素a为蓝绿色。
④待汽油将要达到滤纸边缘时，取出滤纸，待汽油挥发后用铅笔标出各种色素的位置和名称。
(2)叶绿素和类胡萝卜素的分离：
①取叶色素提取液15 mL于分液漏斗中，加20 mL石油醚，再加25 mL蒸馏水，摇动，静置使之分为二层。上层为石油醚叶色素溶液，下层放掉。然后加蒸馏水冲洗一或二次，除去杂质。
②在叶色素石油醚液中加入15 mL 92 %甲醇(注意：甲醇有毒，用时小心)，轻轻摇动，静置分为二层：上层为石油醚提取液，含有叶绿素a和胡萝卜素；下层为甲醇提取液，含叶绿素b和叶黄素。
③取石油醚提取液15 mL于分液漏斗中，加10 mL 20 % KOH甲醇液，加10 mL水，摇荡，静置使之分为二层。上层为胡萝卜素，下层为皂化的叶绿素a。
④取甲醇提取液15 mL，加入分液漏斗中，同时加入15 mL乙醚，轻轻摇动后，沿分液漏斗壁(!!)加入蒸馏水，每次不超过5 mL，每加一次轻轻摇动分液漏斗，使之混合。继续加水至两层溶液显著地分开为止。完成此过程至少需用10 mL蒸馏水，此时色素已全部转入乙醚液中。把下层甲醇放掉。然后取乙醚液10 mL加10 mL 20 % KOH甲醇液，摇荡后观察颜色变化。最后再加蒸馏水10 mL，摇荡后静置使之分为二层：上层为叶黄素，下层为皂化的叶绿素b。
【注意事项】
1．作叶色素纸型色层分离时，滤纸条下端的点样处应在汽油的液面以上。
2．分离叶黄素时，在分液漏斗中加入甲醇提取液和乙醚后，再加水时应沿分液漏斗壁加入蒸馏水，这样才能使溶液分为二层。
【思考题】
1．用不含水的有机溶剂，如无水乙醇、无水丙酮等提取叶绿素，特别是干材料的叶绿体色素往往效果不理想，原因何在？
2．解释四种光合色素在色层分析纸上出现的顺序？
【原理】
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇、叶绿醇形成的复杂酯。因而可与碱起皂化作用，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都具有光学的活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质也很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。叶绿素中的镁可被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
皂化反应如下：
【仪器设备】
1.手持分光镜； 2.小烧杯；
3. 15×150 mL试管； 4.试管架；
5.酒精灯； 6.移液管；
7.试管夹； 8.玻棒。
【试剂】
1. 95 %酒精； 2. 20 % KOH甲醇液；
3.苯； 4. 0.5 mol · L-1HCl；
5.醋酸铜粉末。
【材料】
菠菜叶提取液。
【方法步骤】
将前面实验中的叶绿素提取液用95 %酒精稀释1倍，进行以下实验。
1.皂化作用：
(1)用刻度吸管吸取叶绿体色素提取液5 mL放入试管中，再加入5 mL 20 %的KOH甲醇溶液，充分摇匀。
(2)片刻后，加入5 mL苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1～1.5 mL蒸馏水，轻轻混匀(勿激烈摇荡)，于试管架上静置。可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇和甲醇溶液，其中溶有皂化叶绿素a和b(以及少量叶黄素)；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
2.叶绿体色素的吸收光谱：将已分离开的叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素，在直射光下(日光或灯光)用手持分光镜观察各种色素的吸收光谱，与太阳光的光谱进行比较。把观察的结果用简单的图表示出来。
3.叶绿素的荧光现象：取叶绿体色素提取液5 mL，在明亮处观察，透射光下显绿色，反射光下显樱红色。
4. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg的取代作用：
(1)取两个试管，第一管加叶绿体色素提取液2 mL，作为对照。第二管加叶绿体色素提取液5 mL和1～2滴0.5 mol · L-1HCl，摇动，溶液逐渐变为褐色。
(2)将褐色溶液分出一半装在另一试管中，静置，则可见褐色物质自溶液中分离出来。在另一半溶液中加入一小粒醋酸铜结晶，慢慢加热，则溶液转为蓝绿色。
【思考题】
1．何谓吸收光谱？叶绿素和类胡萝卜素吸收光谱有何差异，并说明其生理意义。
2．人们可从叶绿体色素提取液中观察到荧光现象，为什么在活的叶片中观察不到此现象？
【原理】
根据叶绿素对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，而后用公式计算叶绿素含量。
根据比尔定律，某有色溶液之吸光度应与其浓度C和液层厚度L成比例，即：
D = KCL
式中，K为比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1 cm时，K为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光值而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80 %丙酮提取液中，在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm和645 nm；又已知在波长663 nm下，叶绿素a、b的80 %丙酮溶液的比吸收系数分别为82.04和9.27。在波长645 nm下分别为16.75和45.6，可据此列出下列关系式：
A663= 82.04Ca+ 9.27Cb （1）
A645= 16.75Ca+ 45.60Cb （2）
式(1)、(2)中的A663和A645为叶绿素溶液在波长663 nm和645 nm时的吸光度；
Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度。
解方程组(1)、(2)并转换成mg · L-1单位得：
Ca= 12.72A663－2.59A645 （3）
Cb= 22.88A645－4.67A663 （4）
将Ca与Cb相加，即得叶绿素总量CT：
CT =Ca+Cb= 20.29A645+ 8.05A663 （5）
另外，由于叶绿素a、b在652 nm处的吸收峰相交，二者具有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素总量：
（6）
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度计法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80 %丙酮提取液中3种色素含量的计算公式：
Ca= 12.21A663－2.81A646 （7）
Cb= 20.13A646－5.03A663 （8）
（9）
式中，Ca、Cb：叶绿素a和b的浓度；Cx · c：类胡萝卜素的总浓度；A663、A646和A470：叶绿体色素提取液在波长663 nm、646 nm和470 nm下的吸光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其它溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素a、b在96 %乙醇中最大吸收峰的波长分别为665 nm和649 nm，类胡萝卜素为470 nm，据此可列出以下关系式：
Ca= 13.95A665－6.88A649 （10）
Cb= 24.96A649－7.32A665 （11）
（12）
【仪器设备】
1.分光光度计：1台； 2.研钵：1台；
3.量筒：1个； 4.剪刀：1把；
5. 50 mL量瓶：1个； 6.玻棒；
7. 4 cm漏斗：1个； 8. 7 cm滤纸：1张；
9.滴管：1支。
【试剂】
80 %丙酮。
【材料】
任何绿色植物组织或器官。
【方法步骤】
(一)研磨法
1.取样、剪碎、混匀，然后称取新鲜样品0.1 g。
2.样品置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及0.5 mL纯丙酮研成匀桨，再加80 %丙酮10 mL继续研磨至组织变为白色。
3.取滤纸一张，放入漏斗中用80 %丙酮湿润，把提取液倒入漏斗中，滤入25 mL量瓶里，用少量丙酮冲洗研钵数次，最后连残渣一起倒入漏斗。
4.用滴管吸取80%丙酮，一滴一滴的将滤纸上的叶绿素提取液全部洗入量瓶内，直到滤纸和残渣中无绿色止。最后用80 %丙酮定容至25mL。
5.把叶绿体色素提取液倒入光径1 cm的比色杯内，用分光光度计分别在波长645 nm、663 nm和652 nm下测定吸光度，以80 %丙酮为空白对照。
6.按公式（3）、（4）、（5）、（6）分别计算叶绿素a、b和叶绿素的总浓度（mg · L-1），若用96 %乙醇，需在波长665 nm、649 nm和470 nm下测定吸光度，则按公式（10）、（11）、（12）计算叶绿素a、b和类胡罗卜素含量，（10）、（11）式相加即得叶绿素总浓度。
7.求得色素浓度后再按下式计算组织中各色素含量(用mg · g-1鲜重或干重表示)
式中：C：叶绿体色素的浓度mg · L-1；FW：鲜重g；VT：提取液总体积（mL）；n：稀释倍数。
(二)直接浸提法
1.将新鲜小麦叶片剪成0.2 cm左右的细丝或小块混合均匀后，称取0.10～0.20 g，放入25 mL容量瓶或具塞刻度试管中。
2.在容量瓶或试管中加入0.5 mL纯丙酮和10～15 mL 80 %的丙酮，并仔细将粘附在瓶壁边缘的叶片碎未洗到丙酮溶液中去，盖上瓶塞，室温下置暗处浸提过夜，其间摇动3～4次。
3.次日取出容量瓶，观察叶组织已全部变白时，表示叶绿素已浸提干净，然后用80%丙酮定容至25 mL刻度，过滤或离心后，与研磨法同样进行比色测定。
【注意事项】
1.为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。并尽可能缩短研磨时间，以不超过2 min为宜。
2.直接浸提法也可采用丙酮-乙醇-水混合液，其配制比例为：纯丙酮∶无水乙醇∶蒸馏水= 4.5∶4.5∶1。
3.若是干材料，可经研磨过筛后，称取0.10 g左右，与鲜样同法浸提（但不用加0.5 mL纯丙酮）。
4.用分光光度法测定叶绿体色素含量，对分光光度计本身的精确性要求较高，分光光度计在使用前需对波长进行校正。校正的方法除按仪器说明校正外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。因为即使用国产仪器中性能较好的7200型分光光度计，经校正后在600～700 nm波段中的读数误差还可能有±2 nm，这对测定叶绿素a∶b值已有影响，具体校正步骤可参照参考文献2中的方法进行。
【思考题】
1.叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？
2.用比色法测定叶绿素含量应注意哪些问题？
呼吸作用是植物所有生活细胞所共有的生命活动，是新陈代谢的一个重要组成部分，是植物生理活动所需能量的来源。呼吸速率是植物生命活动强弱的重要指标，同时又受环境的影响。不同植物、同一植物的不同器官以及不同发育时期其呼吸速率不同。在粮食和果蔬的储藏中，控制呼吸速率是安全储藏的基础。因此，在植物生理研究和生产实践等方面都有测定必要。本实验要求了解用干燥器法、小筐子法和微量减压法测定呼吸速率的原理，掌握其测定方法。
【原理】
在密闭容器中放入萌发的种子(或其它生活组织)，呼吸作用消耗容器中的氧气，放出二氧化碳，放出的二氧化碳为容器中Ba(OH)2吸收。实验结束后，用草酸溶液滴定剩余碱液，从空白和样品二者消耗草酸溶液之差，可计算出呼吸过程中释放的CO2量。其反应如下：
【仪器设备】
1.小筐子法测呼吸装置(图5-2)：7套；
2.电子天平（感量1 mg）：1台；
3.分析天平（感量0.1mg）：1台；
4.酸式滴定管及碱式滴定管：各1支；
5.滴定管架：1套。
【试剂】
1.
mol·L-1草酸溶液：准确称取重结晶的
2.8636 g，溶于蒸馏水中，定容至1000 mL。
2. mol·L-1氢氧化钡溶液：称取
8 g，溶于1000 mL蒸馏水中。
3.酚酞指示剂：1 g酚酞溶于100 mL 95 %酒精中。
【材料】
发芽的小麦种子和风干的小麦种子。
【方法步骤】
1.取500 mL广口瓶7个，盖上三孔橡皮塞，一孔插盛碱石灰的干燥管(使呼吸过程中能进入无CO2的空气)，一孔插温度计，另一孔直径1 cm，先用玻璃棒塞紧，滴定时插入滴定管。在瓶塞下面有挂钩，挂铁丝小筐，以便装植物材料。整个装置称作小筐子测呼吸装置(图5-2)。
2.在每个广口瓶中加入含有酚酞指示剂的
mol·L-1氢氧化钡溶液20 mL，立即塞紧橡皮塞。其中一瓶作对照。
3.取三个铁丝小筐，分别放入萌发的小麦种子各100粒，或称取5～10 g的植物材料。另外取三个铁丝小筐，分别放入风干小麦种子100粒。将盛种子的小筐挂在橡皮塞下方的小钩上，放入广口瓶中，塞紧橡皮塞，开始记录时间。经30 min(其间轻轻摇动数次，使溶液表面的碳酸钡薄膜破坏，而利于CO2的充分吸收)，轻轻开塞，把装有植物材料的小筐迅速取出，立即重新塞紧。充分摇动2 min，使瓶中CO2完全被吸收，然后拔出玻棒，插入滴定管，用草酸滴至无色。注意防止口中呼出气体侵入瓶内。
4.计算呼吸速率：
呼吸速率(mg CO2· 100粒-1种子· h-1)＝
若样品以重量计：
呼吸速率(mg CO2· g-1组织· h-1)＝
式中：
—为空白滴定值（mL） 
—为样品滴定值（mL）
—反应时间（h） 
—样品重量（g）
注：每毫升1/44 moL-1的草酸相当于1mgCO2
生长素是最早发现的内源激素，它对植物生长有特定的生理作用。在研究生长素对植物生长发育调节和控制规律时，需要鉴别其活性和含量。目前除用酶联免疫法、分光光度法及色谱法鉴定生长素外，还可用生物法来鉴定。本实验学习用芽鞘伸长法来鉴定生长素的含量。
【原理】
生长素能促进禾本科植物胚芽鞘的延伸生长。切去顶端的胚芽鞘切段，断绝了内源生长素的来源，其伸长在一定范围内与外加生长素溶液浓度的对数呈线性关系。因此，可以用一系列已知浓度的生长素溶液培养芽鞘切段，绘制成生长素浓度与芽鞘伸长的关系曲线，以鉴定未知样品中生长素的含量。
【仪器设备】
1.恒温箱：1个； 2.移液管：10 mL 1支，1 mL 1支；
3.搪瓷盘（带盖）：1个； 4.贴有毫米方格纸的玻璃板一块；
5.培养皿（直径7 cm）：5套； 6.镊子：1把；
7.玻璃丝：若干；
8.简易切割刀（用有机玻璃和两片双面刀片制成，两刀片间距约4 mm）：1个。
【试剂】
1. 1 %次氯酸钠。
2.含2 %蔗糖的磷酸–柠檬酸缓冲液（pH 5.0）：称取磷酸氢二钾（K2HPO4）1.794 g，柠檬酸1.019 g，蔗糖（分析纯）20 g，定容至1000 mL蒸馏水中。
3.吲哚乙酸溶液：精确称取吲哚乙酸17.5 mg，溶于含2 %蔗糖的磷酸–柠檬酸缓冲液中，并用该溶液定容至100 mL，即得10-3mol · L-1吲哚乙酸溶液。
【材料】
成熟、饱满、大小一致的纯种小麦籽粒。
【方法步骤】
1.选取小麦种子100粒，洗净，浸泡于水中，待吸胀后再用1 %次氯酸钠溶液浸泡15 min，取出后用自来水和蒸馏水冲洗至无气味，腹沟朝下成横排摆放在铺有洁净滤纸的带盖搪瓷盘中，盘中加适量水并加盖。为了使芽鞘基部无弯曲，需将搪瓷盘斜放成40~50ο角，使胚倾斜向下，置25 ℃暗室中培养72 h，至胚芽鞘长约25～30 mm。
2.精选芽鞘长度一致的幼苗50株，用镊子从基部取下芽鞘，再用切割器在贴有方格纸的玻璃板上，切去芽鞘顶端3 mm，再向下切取1㎝长的切段50个，立即放入pH 5.0磷酸蔗糖缓冲液中浸泡1～2 h，以去除内源激素。
3.取干净的培养皿5套，向各皿中加pH 5.0的蔗糖磷酸缓冲液9 mL，然后在①号皿中加入10-3mol · L-1IAA 1mL，摇匀，即成10-4mol · L-1IAA溶液，从①号皿中取1 mL溶液放到②号皿中，摇匀，即成10-5mol · L-1IAA溶液；依次操作到④号皿，即依次配成10-4mol · L-1、10-5mol · L-1、10-6mol · L-1、10-7mol · L-1IAA溶液。从④号皿中吸出1 mL溶液弃去。⑤号皿不加IAA作为对照。
4.从缓冲液中取出胚芽鞘切段，用滤纸吸去表面水分，将切段套在玻璃丝上（注意仔细操作，勿损伤芽鞘）。同一根玻璃丝可套2～3段芽鞘，切段间应留有供生长的空隙。套好后置培养皿中，每一皿中放10根，加盖在25 ℃暗箱或暗室中培养。
5. 24 h后取出，吸去表面液体，在毫米方格纸上测其长度，并计算不同处理中芽鞘切段的平均长度。以处理芽鞘长度（L）和对照芽鞘长度（L0）之比（L / L0）为纵轴，IAA浓度的负对数（lg C）为横轴作标准曲线。
6.对于未知浓度的生长素提取液或其他类似物溶液，均可按上述方法求L / L0，查标准曲线，即可计算出其浓度或效价。
【注意事项】
若有摇床设备，可不必用玻璃丝，而将芽鞘直接放入培养皿或者三角瓶中置摇床上缓慢摇动使芽鞘经常滚动，可避免弯曲。
【思考题】
将芽鞘切段套在玻璃丝上目的是什么？
植物在受到各种逆境(如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染等)危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，导致膜透性增大。因此细胞膜通透性的变化反映了外部不良环境对植物细胞的伤害程度，同时细胞膜在逆境下的稳定性也反映了植物抗逆性的高低。
【原理】
逆境条件下植物细胞的膜系统首先受到伤害，细胞膜透性增大，内容物外渗，若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加。组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。用电导仪测定外渗液电导率的变化，可以反映出质膜受伤害的程度。在电解质外渗的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液中可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量的增加。氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，用紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同样可反映出质膜受伤害的程度。电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性。
【仪器设备】
1. DS—11A型电导仪； 2.真空泵；
3.真空干燥器； 4.恒温水浴；
5.打孔器； 6.剪刀；
7.电子天平； 8.试管：20 mL×6；
9.移液管：10 mL ×1； 10.玻璃棒；
11.滤纸。
【试剂】
去离子水。
【材料】
正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米或其他植物的叶片。
【方法步骤】
1.清洗器具：所用玻璃仪器先用热肥皂水洗涤，再用洗液洗涤，然后以自来水、无离子水各冲洗四到五遍（最好是容器口朝下冲洗）。向洗净的试管中加入无离子水，用电导仪测定电导值，检查试管是否确实洗净。
2.取样及处理：选取小麦或其他作物一定叶位和叶龄的功能叶片，一份放入水中作为对照，另一份放入40 ℃烘箱中或其他胁迫条件下使其萎蔫，作为处理。对照和处理各取3个叶片，用自来水洗去表面灰尘，再用去离子水冲洗一次，用干净纱布擦去水分。将叶片叠起，剪取0.5 cm长的片段12个（或用打孔器打取12个叶圆片），放入试管内，然后加入10 mL去离子水。对照和处理均设3个重复。
将试管放入真空干燥器内，开动真空泵抽气10 min，以抽出细胞间隙空气。缓慢放入空气，水即渗入细胞间隙，叶片变成半透明状。取出试管，间隔2～3 min震荡一次，室温下保持30 min。
3.外渗液电导率测定：将DDS—11A型电导仪电极插入外渗液，测定其电导值（L1）。测定之后，将试管放入沸水浴中加热3~5 min以杀死组织。待冷至室温后，再次测定外渗液的电导值（L2）。
4.结果计算：
(1) 以细胞膜相对透性大小表示细胞受害的程度。按下式计算：
细胞膜相对透性（%）=
式中：L1为叶片杀死前外渗液电导值；L2为叶片杀死后外渗液电导值；
(2)直接计算细胞膜伤害率，通常采用下式计算：
伤害率（%）=
式中，C1：对照叶片杀死前外渗液的电导值；C2：对照叶片杀死后外渗液的电导值；
T1：处理叶片杀死前外渗液的电导值；T2：处理叶片杀死后外渗液的电导值。
【注意事项】
1.电导率变化非常灵敏，稍有杂质即产生很大误差。因此仪器清洗是否彻底对结果影响较大。
2.材料细胞间隙空气排除情况直接影响电解质外渗速率，所以应仔细把握材料抽气环节，一定要彻底排除细胞间隙空气。
3. 5 min煮沸杀死植物组织后，浸出液会有所减少，应于冷却后加入适量无离子水，以补足原有浸出液体积。
4.温度变化对电导率有一定影响，材料杀死前后溶液电导率测定应保持在同一温度为宜。切割或打取植物材料时，应使用锋利的刀具或打孔器，以避免组织机械损伤所引起的人为误差。
【思考题】
1.用本方法如何比较不同植物组织的抗逆性？试设计一试验，以鉴定不同品系小麦之间的抗寒性差异。
2.植物材料的不同取样量及浸泡材料的不同无离子水体积对结果有何影响？
3.细胞膜伤害率计算公式有什么含义？
