植物内生菌菌种冷冻干燥、低温保藏技术规程保藏技术规程

1、范围

本规程适用于本平台存储的植物内生菌资源及其他有益细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等微生物菌种的保藏。

2、冷冻干燥法保藏

原理：将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。

适用范围：适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。

技术规程

① 安瓿管准备

清洗安瓿管，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

② 保护剂的选择和准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。

③ 冻干样品的准备

在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/mL为宜。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2mL，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

④ 预冻

一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。

⑤ 冷冻干燥

采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。

⑥ 保藏

安瓿管应低温避光保藏。

⑦ 保藏周期

不同微生物复苏周期不同，一般10年左右。

⑧ 复苏方法

先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。

3、液氮超低温保藏

原理：液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

适用范围：各类微生物。

技术规程

① 安瓿管或冻存管的准备

用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

② 保护剂的准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。

③ 微生物保藏物的准备

接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；

④ 预冻

 分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟1-1.5℃。

⑤ 保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。

保藏时间：一般10年以上

复苏方法：从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

4、低温冷冻保藏

将菌种保藏在-20℃或-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。保藏方法同冷冻干燥。

保藏周期：一般1-5年

复苏方法：从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

适用范围: 各类微生物。

                        山西省植物内生菌资源共享服务平台

2017 年4 月15 日